Cosmider - för att en av studenterna frågade

Fick frågan - Vad är en cosmid? - av en student igår. Lite hastigt sa jag att det är som en plasmid, men att den kan innehålla stora mängder extra DNA, till exempel genomiskt DNA. Men det fick mig att fundera över vad som faktiskt definierar en cosmid. Så satte mig och läste på lite och skrev en liten artikel som studenten ska få på måndag.

Cosmider utvecklades under sena 1970-talet som ett svar på behovet av vektorer kapabla att ackommodera stora segment av genomiskt DNA. Cosmider är konventionella plasmider som har ett prokaryotiskt replikationsorigin (vanligtvis colE1 eller pMB1), en selektionsmarkör och en eller flera restriktionsplatser som kan användas för att stoppa in segment av genomiskt DNA. Cosmider har även ett, eller oftare två kopior av en liten region av bakteriofag lambda DNA - den 280 bp cos-sekvensen - som kan klyvas av lambda-kodade terminasproteinet för att generera linjära molekyler med 12 baser i längd komplementära ssDNA-ändar. Rekombinanta cosmider som bär på segment av genomiskt DNA klyvt av lambda terminas kan packas in vitro i bakteriofag lambda partiklar och transduceras till Escherichia coli. När den rekombinanta cosmiden väl är inne i bakterien cirkulariseras den och replikeras sedan som en stor konventionell plasmid med ett kopieantal 15-20 per cell. Denna trojanska häst av in vitro packning och transduktion designades för att lösa problemet med att effektivt introducera stora plasmider i E. coli.

Tyvärr så fanns det ett problem med cosmiderna - deras kapacitet var helt enkelt inte tillräckligt stor för att effektivt handskas med något så stort som ett däggdjurs genom. Cosmider är tillräckligt stora för att kunna ackommodera en typisk prokaryot gen, men inte en hel typisk däggdjursgen. (På grund av att den maximala mängden DNA som kan packas i en bakteriofag lambda partikel är 52 kb. Cosmidvektorer som vanligtvis är 8 kb i storlek kan ackommodera mellan 31 till 44 kb av främmande DNA). Segment av genomiskt DNA i denna storleksordning genereras genom partiell klyvning av genomiskt DNA med ett restriktionsenzym så som Sau3A som känner igen en 4-bp sekvens och genererar klibbiga ändar. DNA fragment av passande storlek isoleras genom sukros gradientcentrifugering och ligeras till en cosmidvektor som lineariserats med BamHI.

Cos härstammar från cohesive site. Cos-sekvensen är ett 200 bp långt segment som behövs både för att initiera och terminera packningen av ett monomert genom från konkatemeriskt DNA. Stället där terminase introducerar ett hack för att generera klibbiga ändar kallas cosN. När lambdafager började att studeras så trodde man att cosN var nödvändigt och tillräckligt för att DNA skulle packas i capsiden. Senare studier visade att cos är mer komplext och består av 3 eller kanske 4 distinkta subsäten. Både initiering och terminering av packning kräver att ena DNA-strängen hos cosN-sätet har klippts. Dessutom krävs närvaron av ett det så kallade cosB-sätet, vilket går att hitta direkt nerströms efter cosN. För terminering är det även viktigt att det finns ett så kallat cosQ-site som är lokaliserat upströms av cosN. I2 är en sekvens som finns mellan cosN och cosB som också har en distinkt roll i att DNAt packas effektivt. Så den fullständiga cos-sekvensen består av flera subsäten, där varje subsäte spelar en specifik roll i igenkänning, bearbetning, och packning av viralt DNA.