Enligt en studie ledd av Prof. Nan-Shan Zhong's team, genom att ha testat 1099 laboratorie-konfirmerade fall, har de hittat att de vanligaste symtomen inkluderar feber (88.7%), hosta (67.8%), trötthet (38.1%), slemhosta (33.4%), andnöd (18.6%), halsont (13.9%), och huvudvärk (13.6%). Ytterligare, så var det en del av patienterna som upplevde gastrointestinala symtom, med diarré (3.8%) och kräkningar (5.0%). Denna studie är gjord på en asiatisk population, det kan vara så att symtomprofilen ser något annorlunda ut för de som ej tillhör en annan population.
Källa:
Guan WJ, Ni ZY, Hu Y, Liang WH, Ou CQ, He JX, et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. N Engl J Med. 2020.
Guo, Yan-Rong et al. ?The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status.? Military Medical Research vol. 7,1 11. 13 Mar. 2020
Idag var en chill dag på labbet med några små experiment. Körde ut min PCR-produkt på en agarosgel och det verkar som att K.O cosmiden har fått antibiotikaresistens-kassetten insatt. Transformationen av DY380 med en av comsiderna fungerade inte. Det måste vara cosmidpreppen som är kass efterom att personen som arbetade på projektet innan mig också hade besvär med att få en fungerande transformation. Därför bestämde vi oss att hämta en bakteriestam med cosmiden från -80-frysen för att göra en ny prep. och se om det fungerar då. Slutligen startades övernattskulturer av några av cosmiderna för att verifiera om överkorsning har skett.
Dropdialyserade för första gången idag. Då tar en ett 0.025 µm VSWP membranfilter och blöter det. Membranet flyter på vattenytan och provet som ska dialyserats läggs som en droppe på membranet och lämnas i rumstemperatur i 2 timmar.
Senare under dagen gjordes en transformation av kompetenta DY380 bakterier. Cellerna togs ur -80 frysen och töades på is i tio minuter. DNAt som skulle transformeras in i DY380 tillsattes och sedan lades provet på is i 30 minuter, vilket följdes av en värmechock på 30 grader i 90 sekunder. Medium tillsattes kort efter värmechocken och den nya stammen inkuberades i 30 grader för att tillåta återhämtningen innan den ströks ut på LB agar 100µg/ml ampicillin och 50 µg/ml kanamycin. Stammen inkuberades 30 grader över natt.
I slutet av dagen gjordes en PCR för att verifiera att cosmiden har en apramycinresistenskassett där genen vi är intresserde av bör sitta.
Idag gjordes många olika saker i labbet. Först, poolade PCR-produkterna från 13 och 17 februari och gjorde en PCR-purification med QIAGENs Quick-Start Protocol och eluerade produkten i 50 µl H2O. Därpå utfördes en DpnI klyvning för att bli av med templatet i PCRreaktionerna. Inkuberade klyvningsreaktionen i 37 grader och värmeinaktiverade enzymet genom att värmebehandla 80 grader i 20 minuter. Eller ja, gjorde det i 25 minuter för att vara exakt, eftersom värmeledningsförmågan från värmeblocket genom luft är låg. Drog över på tiden för att vara säker att en inaktivering verkligen ägt rum. Därefter, en Quebecprep av DY380 stammen med cosmid för att rena fram cosmiden och för att kunna göra en bedömning om cosmiden är en knock-out cosmid via PCR. Avslutningsvis, så förbereddes en 1-molarig NaOH lösning och LB agarplattor med ampicillin och kanamycin.
Imorgon ska en cosmid transformeras in i DY380 för att kunna göra en knock-out cosmid med en gen vi är intresserade av. Dessutom, en dropdialys för att göra bufferten i ett av proven saltlöst så att det också kan transformeras in i DY380. Vid elektroporering är det viktigt att provet är saltlöst.
Gjorde om PCRn med nya kontrollprov för att försäkra att proceduren gick rätt till. Och det gjorde den denna gången! Det betyder att det är dags att gå vidare till nästa steg - att bryta ner DNA-templatet med DpnI för att möjliggöra en tight transformation. Syftet med transformationen är att föra in produkten i en lambda RED bakteriestam för att överkorsning ska ske och på så sätt att PCR-produkten ska integreras i cosmiden.
Startade även övernattkulturer av DY380 som innehåller cosmiderna av intresse och selekterade med Ampicillin och Kanamycin. Detta banar väg för nya experiment där cosmiderna ska verifieras med PCR.
Anders Breivik dödade 77 personer den 22 Juli, 2011 och blev dömd till 21 år i fängelse. Innan han blev dömd genomgick han två psykiatriska utvärderingar. Den första utvärderingen löd att han hade paranoid schizofreni och därför var han enligt norsk lag oansvarig för brottet. Men eftersom att Breivik saknade hallucinatoner, disorganiserat tänkande, och var kapabel till att planera dådet under lång tid så ifrågasattes diagnosen. Efter en andra utvärdering drogs slutsatsen att Breivik hade narcissistisk personlighetsstörning kombinerat med patologiskt ljugande, och blev därför ansvarig för brottet.
Källa:
Stein Opjordsmoen. Delusional Disorder as a Partial Psychosis. Schizophr Bull. 2014 Mar; 40(2): 244?247.
Försökte att luska ut vad som hänt med mitt prov då kontrollen utan DNA också gav PCR-produkt. Körde återigen en gel för att se om det var krosskontamination, denna gången med endast kontrollen. Laddade 2µl Gene Ruler 1 kb plus och 5 µl prov med 1µl 6x laddningsbuffer och körde gelen på 100V, 2.0A, i 60 minuter. Sedan färgades DNAt med Midori Green i 60 minuter. Det var inte krosskontamination, kontrollen innehöll också DNA. Så får göra om PCRn och hoppas att den blir rätt denna gången.
Var tvungen att stryka om A's DY380 stammar med cosmiderna eftersom jag gjorde fel vid utstrykningen sist. De ströks ut på selektionsplattor med Ampicillin 100 µg/ml, Kanamycin 50 µg/ml, och Apramycin 50 µg/ml.
Idag också gick det bra på labbet. Gjorde en 1%-ig agarosgel för att köra ut gårdagens PCR-produkt för att se om den var lyckad. Blev fundersam över att kontrollen utan DNA också verkade ha produkt... Kan det ha varit så att det läckte över prov till brunnen bredvid? Annars har jag ingen förklaring till fenomenet. Fick även tips av Veronica att ha i DNA-infärgningsämnet, "Midori green", i gelen istället för att post-staina då detta infärgningsprotokoll spar tid, Beställda verifierings-primers levererades igår, så löste upp DNAt i MQvatten idag för att göra en stamlösning som sedan späddes till en arbetslösning på 10 µM. Avslutningsvis ströks Abdos DY380-stammar innehållande cosmiderna ut för att påbörja verifieringsarbetet. Vi vet inte hur pålitligt hans arbete har varit, således verifieringssteg med PCR. Det var längesen utstrykningar gjorde - första gången på flera år - så vi får se imorgon när bakterierna växt till sig om tekniken var adekvat.
Idag var en bra dag på labbet. Gjorde en stamlösning "ampicillin sodium", och beredde media där bakteriestammarna med cosmiderna ska växa. Cosmiderna ska snart verifieras med PCR för att vi ska kunna försäkra oss om att de är de rätta.
Lyckades att programmera thermocyklern med ett avancerat program för att göra en PCR vars produkt ska undersökas via agarosgelektrofores imorgon. Om PCRn ger en bra produkt så ska detta experimentet upprepas med andra mutagena primers. De mutagena primers används för att amplifiera en antibiotikaresistenskassett som sedan ska rekombineras in i cosmiderna för att skapa så kallade "knock-out cosmider".
